Особенность этой реакции в том, что взаимодействие антигена с антителом происходит в полутвёрдой среде - геле, чаще агаровом, иногда используют крахмальный гель, полиакриламидный и т. п.

Реакцию преципитации в геле ставят в чашках Петри или на предметных стёклах. Ингредиенты реакции - антиген и антитела - помещают в лунки (колодцы), которые вырезают в агаре.

Различают два метода постановки диффузионной преципитации в агаре: метод простой (или радиальной) иммунодиффузии, когда одно из реагирующих веществ из лунки диффундирует в агар, содержащий постоянную концентрацию другого реагирующего компонента, и метод двойной иммунодиффузии, когда и антиген, и антитело, помещённые в лунки, диффундируют навстречу друг другу в слое агарового геля. На месте встречи антигена и антитела образуются зоны преципитации (кольцо из преципитата при простой иммунодиффузии и линии из преципитата - при двойной иммунодиффузии). В зависимости от сложности системы антиген - антитело может появляться одна или несколько линий преципитации. Чтобы установить титр преципитирующей сыворотки ставят реакции преципитации с различными разведениями антигена. То максимальное разведение антигена, дающее преципитацию с сывороткой, и является титром данной преципитирующей сыворотки.

Примером реакции преципитации в геле может служить реакция между дифтерийным токсином и противодифтерийной сывороткой, которая носит название реакции двойной иммунодиффузии по Оухтерлони.

Токсигенные культуры дифтерийных палочек, посеянные бляшками.

Нетоксигенные культуры, посеянные бляшками.

Фильтровальная бумага, пропитанная противодифтерийной сывороткой.

Линии из преципитата.

Агаровый гель.

Иммуноэлектрофорез сочетает метод электрофореза и реакции преципитации. Смесь антигенов разделяется в геле с помощью электрофореза, затем в канавку параллельно зонам электрофореза вносится иммунная сыворотка, антитела которой диффундируют в гель и образуют в месте встречи с антигеном линии из преципитата.

С его помощью успешно анализируются белки сыворотки крови, цереброспинальной жидкости, мочи, молока, экстрактов из органов, а также белки растительного и бактериального происхождения.

Реакции лизиса.

Для этого надо знать:

Иммунный лизис - это растворение клеток под при обязательном участии воздействием антител комплемента.

Для реакции необходимы:

1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.

2. Антитело - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного.

Иммунную сыворотку получают гипериммунизацией кролика соответствующим корпускулярным антигеном (микробные клетки, эритроциты и др.). Например, в реакции гемолиза и реакции связывания комплемента (см. ниже) используется гемолитическая сыворотка, которую получают гипериммунизацией кролика эритроцитами барана; полученная таким образом сыворотка крови кролика содержит антитела (гемолизины) к эритроцитам барана. Таким образом получают и бактериолитические сыворотки, содержащие антитела, участвующие в лизисе бактерий.

3. Комплемент - термолабильный сложный комплекс белков сыворотки крови, при активации реагирующих между собой в определённой последовательности и образующих мембраноатакующий литический комплекс. В сыворотке комплемент находится в неактивном состоянии и активируется в момент образования комплекса антиген - антитело (адсорбируется на комплексе антиген - антитело). Комплемента много в свежей сыворотке морских свинок.

Из реакции лизиса чаще других применяется реакция гемолиза и реже бактериолиза (главным образом, для дифференциации холерных и холероподобных вибрионов).

Постановка реакции гемолиза .

Для постановки реакции гемолиза необходимы:

3 % взвесь эритроцитов барана на изотоническом растворе;

Стандартная гемолитическая сыворотка, приготовленная в производственных условиях и разведённая изотоническим раствором в 2 - 3 раза меньше, чем её титр (титр гемолитической сыворотки - то наибольшее разведение её, при котором происходит полный гемолиз 3 % взвеси эритроцитов барана в присутствии комплемента);

Комплемент, разведённый изотоническим раствором 1:10.

Если в пробирку поместить в определенных количественных соотношениях эритроциты барана (антиген), гемолитическую сыворотку (антитело) и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет изменение смеси: из темно-красной она становится розовой (лаковой) вследствие разрушения эритроцитов и выхода гемоглобина.

Реакция гемолиза обладает строго выраженной специфичностью. Ее используют в качестве индикатора для постановки реакции связывания комплемента.

РЕАКЦИЯ ПРЕЦИПИТАЦИИ В ГЕЛЕ, РПГ
(Gel precipitation test)

Метод выявления антигенов и антител, основанный на диффузии компонентов через слой агарового (агарозного) геля и образования видимого преципитата на участках, где создаются их эквивалентные концентрации.

Чаще всего используется метод двойной (встречной) диффузии, предложенный О. Ухтерлони в 1948 г., при котором антигены и сыворотки вносятся в противостоящие лунки, вырезанные в пластинке геля; через определенное время в толще геля образуются преципитационные полосы, соответственно числу антигенов и антител совпадающей специфичности. Кроме того, метод позволяет проводить сравнение нескольких антигенов между собой при некой стандартной сыворотке: в случае их идентичности образуемые ими полосы преципитации сливаются в сплошную линию и, наоборот, полосы пересекаются, если сравниваемые антигены имеют различия (т. н. феномен “шпоры”). Другим преимуществом РПГ является то, что смеси антигенов могут разделяться за счет разной скорости диффузии и выявляться индивидуально; по этой же причине могут отделяться и ингибиторы преципитации, если они содержатся в испытуемом материале. Недостатком метода считают его низкую чувствительность, иначе, разрешающую способность. РПГ широко использовалась как тест на обнаружение антигенов вируса гепатита В и антител к ним в 60 - 70-е годы, в частности, с помощью этой реакции было установлено наличие в составе вируса е-антигена или

Реакцией преципитации (РП) называется осаждение из раствора Аг (преципитиногена) при воздействии на него иммунной сыворотки (преципитина) и электролита. Посредством РП можно выявить антиген в разведениях 1:100 000 и даже 1:1 000 000, т. е. в таких малых коли­чествах, которые не обнаруживаются химическим путем.

Преципитиногены представляют собой ультрамикроскопические час­тицы белково–ПС прир: экстракты из мкÒ, органов и тк, пат материала; продукты распада бакте­риальной клетки, их лизаты, фильтраты. Преципитиногены обладают термоустойчивостью, поэтому для их получения материал подвергается кипячению. В РП используются жидкие прозрачные Аг.

Преципитирующие сыворотки обычно получают гипериммунизацией кроликов циклами в течение нескольких месяцев, вводя им бактериальные взвеси, фильтраты бульонных культур, аутолизаты, солевые экстракты микроорганизмов, сывороточные белки.

Постановка РП Асколи. В узкую пробирку с небольшим кол-вом неразведенной преципитирующей сыворотки, держа ее в наклонном положении, пипеткой медленно по стенке наслаивается такой же объем Аг. Чтобы не смешать две жидкости, пробирку осторожно ставят вертикаль­но. При положительной реакции в пробирке на границе между сыворот­кой и исследуемым экстрактом через 5–10 мин появля­ется серовато–белое кольцо. Постановка реакции обязательно сопровождается контролями сыворотки и антигена.

Реакция Асколи применяется для идентификации сибиреязвенного, туляремийного, чумного Аг. Она нашла также применение в су­дебной медицине для опред-я видовой принадлежности белка, в частности кровяных пятен, в санитарной практике при выявлении фаль­сификации мясных, рыбных, мучных изделий, примесей в молоке. Не­достатком этой РП является нестойкость преципитата (кольца), который исчезает даже при легком встряхивании. Кроме того, с ее помощью нельзя определить количественный состав Аг, участвующих в формиро­вании преципитата.

Реакция преципитации Оухтерлони. Реакцию ставят на чашках Петри в лунках агарового геля. В качестве геля используют хорошо отмытый прозрачный агар. Аг и сыворотки вносятся в агаровый гель так, чтобы лунки, содержащие их, находились на определенном рассто­янии. Диффундируя навстречу друг другу и соединяясь друг с другом, антитело и антиген образуют через 24–48 ч иммунный комплекс в виде белой полосы. При наличии сложного по составу преципитиногена возникает несколько полос. При этом полосы серологически родственных антигенов сливаются воедино, а полосы разнородных пере­крещиваются, что позволяет определить детали антигенной структуры исследуемых веществ. Широко используется для диагностики заболева­ний, вызываемых вирусами и бактериями, продуцирующими экзотоксины.

3.Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА). Ставится для обнару­жения полисахаридов, белков, экстрактов бактерий, микоплазм, риккетсий и вирусов, иммунные комплексы которых с агглютининами в обыч­ных классических РА увидеть не удается, или же для выявления антител в сыворотках больных к этим высокодисперсным веществам и мельчай­шим микроорганизмам.

РНГА для серодиагностики инфекционных болезней. Используя РНГА для обнаружения антител в сыворотках больных, готовят ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ АНТИГЕННЫЕ ДИАГНОСТИКУМЫ. Для этого эритроциты обрабаты­вают 15 мин раствором танина в разведении 1:20 000–1:200 000, что придает им устойчивость и повышает адсорбционную способность. Затем их смешивают с известным антигеном и инкубируют в течение 2 ч при температуре 37°С.. Сенсибилизированные антигеном эритроциты 2–3 раза отмывают изотоническим раствором натрия хлорида и добавляют к сыворотке, разведенной и разлитой в лунки панелей. Контролем служат взвеси интактных и нагруженных антигеном эритро­цитов, которые вносят в сыворотки, дающие заведомо положительную и отрицательную реакции.

Результаты реакции учитывают через 2 ч после инкубации в термостате и оценивают плюсами: «++++» – эритроциты покрывают лунку в виде зонтика с неровными краями; «–» – скопление эритроцитов в виде «пу­говицы»

Цель: Владеть техникой постановки реакции агглютинации и реакции преципитации для диагностики инфекционных заболеваний.

Модуль 1. Морфология и физиология микроорганизмов. Инфекция. Иммуни-тет.

Тема 16: Реакция агглютинации. Реакция преципитации.

Актуальность темы. Под иммунитетом подразумевают невосприимчивость организма к инфекционным и неинфекционным агентам (патогенных микроорганизмов, чужеродных белков и др. веществ). Эти агенты получили названия антигенов. Иммунитет бывает врожденным и приобретенным. Врожденный – когда формируются тканевые и гуморальные защитные приспособления, обуславливающие невосприимчивость к инфекционным заболеваниям, передающимся по наследству.

Приобретенный – осуществляется иммунной системой организма в виде выработки антител или накопления сенсибилизированных лимфоцитов. Он подразделяется на естественный и искусственный . По механизму действия разделяется на активный и пассивный . Во всех иммунологических реакциях основным компонентом является антиген.

Основной функцией иммунной системы, которая состоит из лимфоидной ткани, является распознавание чужеродных агентов (антигенов) и обезвреживание их.

Антигены могут попадать в организм через дыхательные пути, пищеварительный тракт, через кожные и слизистые покровы. Каждый антиген стимулирует образование особых белковых веществ – антител.

Антигены подразделяются на полноценные и неполноценные (гаптены). Полноценные антигены вызывают полный иммунный ответ. Неполноценные антигены самостоятельно не вызывают иммунного ответа, но иногда приобретают эту способность при конъюгации с высокомолекулярными белковыми носителями. Кроме того, бывают антигены: полугаптены, проантигены, гетероантигены и изоантигены.

Антитела представляют собой иммуноглобулины сыворотки крови человека или животного. Образуются антитела после перенесенной инфекции, и в результате иммунизации ослабленными или убитыми бактериями, риккетсиями, вирусами, токсинами и другими агентами. Антитела – белки иммуноглобулинов по химическому составу относятся к гликопротеидам. По структуре и иммунобиологическим свойствам иммуноглобулины подразделяются на 5 классов : IgM, IgG, IgA, IgE, IgD.

Нормальные антитела обнаруживают у людей и животных не иммунизированных. Специфические антитела образуются в результате перенесенной инфекции или же иммунизации.

Реакции взаимодействия антитела с антигеном называются серологическими . Серологические реакции отличаются высокой специфичностью и применяются при диагностике многих инфекционных заболеваний. Различают реакции агглютинации и преципитации.

1. Реакция агглютинации (РА) основана на взаимодействии антигена (агглютиногена) и антитела (агглютинина), при котором происходит склеивание и выпадение в осадок микробных тел в присутствии электролита. Существуют различные модификации постановки реакции агглютинации.

Наибольшее значение имеют:

- Макроскопическая (развернутая) агглютинация в пробирках. К сыворотке больного добавляют взвесь микробов (диагностикум) и через 1 час в термостате при температуре 37 градусов отмечают разведение (титр) сыворотки, при котором произошла реакция. Положительной считают реакцию агглютинации тогда, когда на дне пробирки образуется осадок с выраженным просветлением надосадочной жидкости. Этот осадок называется агглютинатом.

По характеру агглютината различают мелкозернистую (О) и крупнозернистую (Н) агглютинацию. Для выявления мелкозернистого агглютината пользуются агглютиноскопом. Учет результатов начинают с контрольных пробирок. Последнее разведение сыворотки, в которой наблюдается агглютинация, считают ее титром.

Цель реакции: обнаружение антител в сыворотке больного.

- Микроскопическая (ускоренная) ориентировочная агглютинация на стекле. К капле диагностической иммунной сыворотки вносят каплю бактериальной культуры и равномерно перемешивают. Реакция протекает при комнатной температуре через 5-10 минут. Затем производят учет. При положительной реакции в капле с сывороткой отмечают скопление бактерий в виде зернышек или хлопьев. Цель реакции: определение вида возбудителя по известной диагностической сыворотке.

- Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА). Сущность этой реакции заключается в том, что эритроциты барана способны адсорбировать на своей поверхности антигены. Под воздействием специфических антител, эритроциты склеиваются и выпадают в осадок, образуя на дне гемагглютинат. Реакция отличается высокой чувствительностью и специфичностью. РНГА позволяет обнаружить минимальное количество антител и неполноценные антигены полисахаридной природы. Эту реакцию применяют при диагностики многих инфекционных заболеваний (брюшного и сыпного тифа, паратифов, туберкулеза и др.).

2. Реакция преципитации (РП) – осаждение комплекса антиген-антитело. Основным отличием РП от РА является то, что при РА применяется корпускулярный антиген, а при РП – антиген представляет собой коллоидное вещество белковой или полисахаридной природы. В этой реакции антиген называется преципитиноген, а антитела – преципитины. Реакцию ставят в пробирках наслоением раствора антигена на иммунную сыворотку. При оптимальном соотношении антигена и антител на границе

этих растворов образуется кольцо преципитата. Если в качестве антигена используют прокипяченные и профильтрованные экстракты органов и тканей, реакция называется реакцией термопреципитации (реакция Асколи, которую ставят при диагностике сибирской язвы, чумы, туляремии и др.).

Широкое распространение получили реакции преципитации в агаре: метод простой диффузии, метод двойной диффузии .

Разновидностью преципитации является реакция флокуляции – для определение активности анатоксина или антитоксической сыворотки. Кроме того, можно использовать эту реакцию для определения токсигенности штаммов Corynebacterium diphtheriae.

Конкретные цели:

· Объяснить роль антигенов, как индукторов иммунного ответа;

· Описать структуру антигенов, в том числе антигенов микроорганизмов;

· Описать механизм реакции агглютинации;

· Описать механизм реакции преципитации.

Уметь:

· Пояснить роль антигенов, как индукторов иммунного ответа;

· Описать структуру антител (разных классов иммуноглобулинов);

· Проанализировать механизм взаимодействия антител с антигенами;

· Трактовать результаты реакции агглютинации;

· Трактовать результаты реакции преципитации;

· Анализировать полученные результаты.

Теоретические вопросы:

1. Определение понятия «антигены», «антитела».

2. Роль антигенов как индукторов иммунного ответа.

3. Структура антител (разных классов иммуноглобулинов).

4. Механизм взаимодействия антител с антигенами.

5. Реакции иммунитета, их роль в иммунном ответе и диагностике инфек-ционных болезней.

6. Механизм реакции агглютинации.

7. Механизм реакции преципитации.

Практические задания, которые выполняются на занятии:

1. Постановка реакции агглютинации для выявления антител в сыворотке больного.

2. Постановка реакции микроагглютинации на стекле с диагностическими сыворотками для идентификации чистой культуры бактерий.

3. Оценка результатов реакции агглютинации.

4. Постановка реакции преципитации для выявления антигена бактерий.

5. Оценка результатов реакции преципитации.

6. Оценка результатов реакции непрямой гемагглютинации.

7. Оформление протокола.

Литература:

1. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология с вирусологией и имму-нологией.– Киев: Высшая школа, 1992.- 431с.

2. Воробьев А.В., Быков А.С., Пашков Е.П., Рыбакова А.М. Микробиоло-гия.- М.: Медицина, 1998.- 336с.

3. Медицинская микробиология /Под редакцией В.П. Покровского.– М.: ГЕОТАР-МЕД, 2001.– 768с.

4. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммуноло-гия и вирусология /Учебник для медицинских ВУЗов, С-Пб.: «Специальная литература», 1998.- 592с.

5. Тимаков В.Д., Левашев В.С., Борисов Л.Б. Микробиология /Учебник.- 2-е изд., перераб. и доп.– М.: Медицина, 1983.- 512с.

6. Конспект лекции.

Дополнительная литература:

1. Титов М.В. Инфекционные болезни.- К., 1995.– 321с.

2. Шувалова Е.П. Инфекционные болезни.– М.: Медицина, 1990.- 559с.

Преципитации реакция преципитации реакция

реакция взаимодействия in vitro антигена с антителом, приводящая к видимому невооруженным глазом помутнению среды или образованию осадка иммунного комплекса (преципитата). Применяется для идентификации антигенов и антител, контроля чистоты антигена, количественного определения антигенов и антител в исследуемом материале. Дляпостановки П. р. необходимы прозрачные растворы антигена и соответствующей сыворотки.

(Источник: «Микробиология: словарь терминов», Фирсов Н.Н., М: Дрофа, 2006 г.)

пробирочная реакция взаимодействия Ат с Аг в жидкой фазе или в геле, к-рая приводит к образованию видимых невооруженным глазом иммунных преципитатов (помутнения). Применяют для идентификации Аг и Ат, контроля чистоты Аг, количественного содержания Ат и Аг. Для постановки П. р. необходимы прозрачный р-р Аг, антисыворотка, физраствор или гель (1,5 - 2% агаровый и агарозный в вероналацетатном буфере, рН 6,8, ионная сила - 0,1). Чаще используют следующие методики: 1) реакцию колъцепреципитации. В преципитационную пробирку (пробирки) наливают по 0,2 мл преципитирующей с-ки с высоким титром и на нее осторожно наслаивают примерно такое же количество р-ра Аг (цельного или разведенного). В положительном случае через несколько минут на границе реагентов образуется подвижное кольцо белого цвета. Обязательны контроли Аг, с-ки, заведомо положительный, заведомо отрицательный и др. Применяют для идентификации Аг в экстрактах из различных материалов, в т.ч. инфекц.; 2) двойную радиальную иммунодиффузию по Оухтерлони. В равномерном слое 1% агарового геля толщиной около 1,5 мм пробивают лунки на расстоянии 4-10 мм и заполняют их р-рами антисыворотки и Аг. Результат учитывают через сутки (до 6 - 7 сут) инкубации при 4°, 20° и 37°С на влажном или высушенном и окрашенном препарате по числу и расположению линий преципитации. У однокомпонентных систем между лунками с Аг и Ат появляется одна линия, у многокомпонентных -несколько линий, при идентичных Аг линии сливаются, при неидентичных- пересекаются. Используют для качественного анализа, определения чистоты препаратов, идентификации Ат и Аг; 3) простую линейную иммунодиффузию по Удену. Применяют с теми же целями, что и двойную. Содержащий антисыворотку гель разливают по пробиркам или трубочкам. На гель в пробирках наливают р-р Аг, а трубочки помещают в стаканчик с р-ром Аг. Результаты учитывают после выдерживания системы при +4°С в течение 48 ч по наличию преципитата и фронта, к-рый прошел Аг. По формуле находят количество Аг; 4) простую радиальную иммунодиффузию по Манчини. Гель с моноспецифической с-кой ровным слоем наливают на стеклянную поверхность. После застывания в геле пробивают лунки и заливают в них р-ры иссл. Аг. Систему выдерживают 40 ч при +4° или 20°С. В положительных случаях вокруг лунки образуется преципитат, площадь к-рого отражает количество Аг. Аналогичным образом ставят контроль с серией разведении стандартного Аг. Измеряют диаметр зоны преципитата, высчитывают площадь и по калибровочной кривой находят количество Аг в 1 мл субстрата.

(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)

Смотреть что такое "преципитации реакция" в других словарях:

реакция преципитации - — [Англо русский глоссарий основных терминов по вакцинологии и иммунизации. Всемирная организация здравоохранения, 2009 г.] Тематики вакцинология, иммунизация EN precipitation reaction … Справочник технического переводчика

- (RW или ЭДС Экспресс Диагностика Сифилиса) устаревший метод диагностики сифилиса. В настоящее время заменён микрореакцией преципитации (антикардиолипиновый тест, MP, RPR Rapid Plasma Reagin). Названа по имени немецкого иммунолога Августа… … Википедия

реакция преципитации - rus реакция (ж) преципитации eng precipitin test, precipitation test fra réaction (f) de précipitation (f) deu Präzipitintest (m), Präzipitations Reaktion (f) spa reacción (f) de precipitación, reacción (f) de precipitinas, prueba (f) de… … Безопасность и гигиена труда. Перевод на английский, французский, немецкий, испанский языки

Метод обнаружения и идентификации антител или растворимых антигенов, основанный на феномене преципитации … Большой медицинский словарь

Преципитация (лат. praecipitatio стремительное падение) В химии и биохимии синоним слова осаждение В иммунологии иммунологическая реакция осаждения из раствора нерастворимого комплекса антиген антитело, образующегося в результате соединения… … Википедия

Метод обнаружения малых концентраций антител, моновалентных гаптенов или поливалентных антигенов, основанный на торможении в их присутствии реакций преципитации, агглютинации или связывания комплемента вследствие специфического блокирования… … Большой медицинский словарь

Модификация реакции преципитации, при которой регистрируют формирование преципитата в виде кольца на границе между растворами антигена и антител … Большой медицинский словарь

Тест на наличие сифилиса, в котором определение характерных для этого заболевания антител в крови обследуемого производится с помощью реакции преципитации. Данный тест является менее доступным, чем некоторые другие.