Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к адсорбированному антигену. Схема РНГА представлена на рис. 34. РНГА широко применяют при диагностике ряда инфекций.
Рис. 34. Схема реакции пассивной гемагглютинации (РПГА). А - получение эритроцитарного диагностикума: Б - РПГА: 1 - эритроцит: 2 - изучаемый антиген; 3 - эритроцитарный диагностикум; 4 - антитело к изучаемому антигену: 5 - агглютинат
Постановка реакции. Испытуемую сыворотку прогревают 30 мин при 56° С, разводят последовательно в соотношении 1:10 - 1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитарного диагностикума (эритроциты с адсорбированным на них антигеном).
Контроли: взвесь эритроцитарного диагностикума с заведомо иммунной сывороткой; взвесь диагностикума с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем ее не должно быть.
При помощи РИГА можно определять неизвестный антиген, если на эритроциты адсорбировать заведомо известные антитела.
Реакцию гемагглютинации можно ставить в объеме 0,025 мл (микрометод), пользуясь микротитратором Такачи.
Контрольные вопросы
1. О чем свидетельствует положительный результат РГА между эритроцитами и исследуемым на наличие вируса материалом?
2. Произойдет ли агглютинация эритроцитов, если к ним добавить вирус и соответствующую ему сыворотку? Как называется реакция, выявляющая этот феномен?
Задание
Учтите и зарегистрируйте результат РИГА.
Реакция преципитации
В реакции преципитации происходит выпадение в осадок специфического иммунного комплекса, состоящего из растворимого антигена (лизата, экстракта, гаптена) и специфического антитела в присутствии электролитов.
Образующееся в результате этой реакции мутное кольцо или осадок называют преципитатом. От реакции агглютинации эта реакция в основном отличается размером частиц антигена.
Реакцию преципитации обычно применяют для определения антигена при диагностике ряда инфекций (сибирская язва, менингит и др.); в судебной медицине - для определения видовой принадлежности крови, спермы и др.; в санитарно-гигиенических исследованиях - при установлении фальсификации продуктов; с ее помощью определяют филогенетическое родство животных и растений. Для реакции необходимы:
1. Антитела (преципитины) - иммунная сыворотка с высоким титром антител (не ниже 1:100000). Титр преципитирующей сыворотки устанавливают по наибольшему разведению антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5 - 1:10.
2. Антиген - растворенные вещества белковой или липоиднополисахаридной природы (полные антигены и гаптены).
3. Изотонический раствор.
Основные методы проведения реакции преципитации: реакция кольцепреципитации и реакция преципитации в агаре (геле).
Внимание! Все компоненты, участвующие в реакции преципитации, должны быть совершенно прозрачными.
Реакция кольцепреципитации . В преципитационную пробирку с помощью пастеровской пипетки вносят 0,2-0,3 мл (5-6 капель) сыворотки (сыворотка не должна попадать на стенки пробирки). На сыворотку осторожно наслаивают антиген в таком же объеме, наливая его тонкой пастеровской пипеткой по стенке пробирки. Пробирку при этом держат в наклонном положении. При правильном наслаивании между сывороткой и антигеном должна получиться четкая граница. Осторожно, чтобы не перемешать жидкости, пробирку ставят в штатив. При положительном результате реакции на границе антигена и антитела образуется мутное "кольцо" - преципитат (см. рис. 48).
Реакцию сопровождают рядом контролей (табл. 18). Очень важна последовательность внесения в пробирку ингредиентов реакции. Нельзя наслаивать сыворотку на антиген (в контроле - на изотонический раствор), так как относительная плотность сыворотки больше, она опустится на дно пробирки, и граница между жидкостями не выявится.
Таблица 18. Схема постановки реакции кольцепреципитации
Примечание. + наличие "кольца"; - отсутствие "кольца".
Учет результатов производят через 5-30 мин, в некоторых случаях через час, как всегда начиная с контролей. "Кольцо" во 2-й пробирке свидетельствует о способности иммунной сыворотки вступать в специфическую реакцию с соответствующим антигеном. В 3-5-й пробирках "колец" не должно быть - там нет соответствующих друг другу антител и антигенов. "Кольцо" в 1-й пробирке - положительный результат реакции - говорит о том, что испытуемый антиген соответствует взятой иммунной сыворотке, отсутствие "кольца" ("кольцо" только во 2-й пробирке) свидетельствует о их несоответствии - отрицательный результат реакции.
Реакция преципитации в агаре (геле) . Особенность реакции в том, что взаимодействие антигена и антитела происходит в плотной среде, т. е. в геле. Образующийся преципитат дает в толще среды мутную полосу. Отсутствие полосы свидетельствует о несоответствии компонентов реакции. Эту реакцию широко применяют при медико-биологических исследованиях, в частности при изучении токсинообразования у возбудителя дифтерии.
Контрольные вопросы
1. В чем основное различие между реакцией агглютинации и преципитации?
2. Почему нельзя применять мутные ингредиенты в реакции преципитации?
Задание
1. Поставьте реакцию кольцепреципитации и зарисуйте результат.
2. Изучите характер взаимодействия антигена с антителом в реакции преципитации в агаре, зарисуйте результат (чашку получите у преподавателя).
Реакция лизиса (иммунный цитолиз)
Иммунный лизис - это растворение клеток под воздействием антител при обязательном участии комплемента. Для реакции необходимы:
1. Антиген - микробы, эритроциты или другие клетки.
2. Антитело (лизин) - иммунная сыворотка, реже сыворотка больного. Бактериолитическая сыворотка содержит антитела, участвующие в лизисе бактерий; гемолитическая - гемолизины, способствующие лизису эритроцитов; для лизиса спирохет нужны спирохетолизины, клеток - итолизины и т. д.
3. Комплемент. Больше всего комплемента в сыворотке морских свинок. Эту сыворотку (смесь от нескольких животных) обычно используют в качестве комплемента. Свежий (нативный) комплемент нестоек и легко разрушается при нагревании, встряхивании, хранении, поэтому пользоваться им можно не дольше двух дней после получения. Для консервации комплемента к нему добавляют 2% борной кислоты и 3% сульфата натрия. Такой комплемент можно сохранять при 4° С до двух недель. Чаще применяют сухой комплемент. Перед употреблением его растворяют в изотоническом растворе до первоначального объема (указан на этикетке).
4. Изотонический раствор.
Реакция гемолиза (табл. 19). Для реакции необходимы:
1. Антиген - 3% взвесь отмытых эритроцитов барана из расчета 0,3 мл осадка эритроцитов и 9,7 мл изотонического раствора.
2. Антитело - гемолитическая сыворотка (гемолизин) против эритроцитов барана; обычно готовят на производстве, лиофилизируют и на этикетке указывают титр.
Титр гемолизина - то наибольшее разведение сыворотки, при котором происходит полный гемолиз 3% взвеси эритроцитов в присутствии комплемента. Для реакции гемолиза гемолизин берут в тройном титре, т. е. разводят в 3 раза меньше, чем до титра. Например, при титре сыворотки 1:1200, сыворотку разводят 1:400 (0,1 мл сыворотки * и 39,9 мл изотонического раствора). Избыток гемолизина необходим, так как часть его могут адсорбировать другие компоненты реакции.
* (Меньше 0,1 мл сыворотки брать не следует - страдает точность измерения. )
3. Комплемент разводят 1:10 (0,2 мл комплемента и 1,8 мл изотонического раствора).
4. Изотонический раствор.
Таблица 19. Схема реакции гемолиза
Учет результатов. При правильно поставленной реакции в 1-й пробирке произойдет гемолиз - содержимое ее станет прозрачным. В контролях жидкость остается мутной: во 2-й пробирке для наступления гемолиза недостает комплемента, в 3-й - нет гемолизина, в 4-й - нет ни гемолизина, ни комплемента, в 5-й - антиген не соответствует антителу,
В случае надобности гемолитическую сыворотку титруют по следующей схеме (табл. 20).
Перед титрованием готовят исходное разведение сыворотки 1:100 (0,1 мл сыворотки и 9,9 мл изотонического раствора), из которого делают необходимые разведения, например:
Из этих разведений вносят по 0,5 мл сыворотки в пробирки опыта титрования, как показано в табл. 20.
Таблица 20. Схема титрования гемолитической сыворотки (гемолизина)
В примере, приведенном в табл. 20, титр гемолитической сыворотки равен 1:1200.
При использовании свежей гемолитической сыворотки ее необходимо инактивировать, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56° С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ лучше: он исключает возможность перегрева сыворотки, т. е. ее денатурации. Денатурированные сыворотки непригодны для опыта.
Реакция бактериолиза . В этой реакции комплемент лизирует бактерии в присутствии соответствующей (гомологичной) сыворотки. Схема реакции принципиально сходна со схемой реакции гемолиза. Отличие состоит в том, что после двухчасовой инкубации из всех пробирок делают высев на чашки Петри со средой, благоприятной для взятого в опыт микроорганизма, чтобы узнать, лизирован ли он. При правильно поставленном опыте в посевах из 2-5-й пробирок (контроли) должен быть обильный рост. Отсутствие роста или слабый рост в посеве из 1-й пробирки (опыт) говорит о гибели микробов, т. е. о том, что они гомологичны антителу.
Внимание! Реакцию бактериолиза необходимо проводить в асептических условиях.
Контрольные вопросы
1. Что произойдет с эритроцитами, если вместо изотонического раствора натрия хлорида применить дистиллированную воду? Что лежит в основе этого феномена?
2. Какая реакция произойдет при взаимодействии эритроцитов с гомологичной иммунной сывороткой в отсутствии комплемента?
Задание
Поставьте реакцию гемолиза. Зафиксируйте и зарисуйте результат.
Похожая информация.
Оглавление темы "Иммуномодуляторы. Иммунодиагностика инфекционных заболеваний.":
Развернутая реакция агглютинации (РА ). Для определения AT в сыворотке крови больного ставят развёрнутую реакцию агглютинации (РА) . Для этого к серии разведений сыворотки крови добавляют диагностикум - взвесь убитых микроорганизмов или частицы с сорбированными Аг. Максимальное разведение, дающее агглютинацию Аг, называют титром сыворотки крови.
Разновидности реакции агглютинации (РА ) для выявления AT - кровяно-капельная проба на туляремию (с нанесением диагностикума на каплю крови и появлением видимых белёсых агглютинатов) и реакция Хаддльсона на бруцеллёз (с нанесением на каплю сыворотки крови диагностикума, окрашенного генциановым фиолетовым).
Ориентировочная реакция агглютинации (РА)
Для идентификации выделенных микроорганизмов ставят ориентировочную РА на предметных стёклах. Для этого к капле стандартной диагностической антисыворотки (в разведении 1:10, 1:20) добавляют культуру возбудителя. При положительном результате ставят развёрнутую реакцию с увеличивающимися разведениями антисыворотки.
Реакцию считают положительной, если агглютинацию наблюдают в разведениях, близких к титру диагностической сыворотки.
О-Аг . Соматические О-Аг термостабильны и выдерживают кипячение в течение 2 ч. При взаимодействии с AT образуют мелкозернистые агрегаты.
Н-Аг . Н-Аг (жгутиковые) термолабильны и быстро разрушаются при 100 °С, а также под действием этанола. В реакциях с Н-антисывороткой через 2 ч инкубации образуют рыхлые крупные хлопья (образованы бактериями, склеившимися жгутиками).
Vi-Ar брюшнотифозных бактерий относительно термостабилен (выдерживает температуру 60-62 °С в течение 2 ч); при инкубации с Vi-антисывороткой образуется мелкозернистый агглютинат.
Реакции прямой гемагглютинации
Простейшая из подобных реакций - агглютинация эритроцитов, или гемагглютинация, применяемая для определения групп крови в системе AB0. Для определения агглютинации (или её отсутствия) используют стандартные антисыворотки с анти-А и анти-В-агглютининами. Реакция называется прямой, так как исследуемые Аг - естественные компоненты эритроцитов.
Общие с прямой гемагглютинацией механизмы имеет вирусная гемагглютинация. Многие вирусы способны спонтанно агглютинировать эритроциты птиц и млекопитающих, их добавление к суспензии эритроцитов вызывает образование агрегатов из них.
Лабораторная диагностика практически всех инфекционных заболеваний основана на выявлении в крови больного антител, которые вырабатываются на антигены возбудителя, методами серологических реакций. Они вошли во врачебную практику с конца девятнадцатого - начала двадцатого века.
Развитие науки помогло определить антигенную структуру микробов и химические формулы их токсинов. Это позволило создать не только лечебные, но и диагностические сыворотки. Их получают путем введения ослабленных возбудителей лабораторным животным. После нескольких дней выдержки из крови кроликов или мышей готовят препараты, используемые для идентификации микробов или их токсинов, используя серологические реакции.
Внешнее проявление такой реакции зависит от условий ее постановки и от состояния антигенов в крови больного. Если частички микробов нерастворимы, то они осаждаются, лизируются, связываются или иммобилизуются в сыворотке. Если антигены растворимы, то проявляется феномен нейтрализации или преципитации.
Реакция агглютинации (РА)
Серологическая реакция агглютинация является высокоспецифичной. Она проста в исполнении и достаточно наглядна, чтобы быстро определить наличие антигенов в сыворотке крови больного. Ее используют для постановки реакции Видаля (диагностика брюшного тифа и паратифа) и Вейгля (сыпной тиф).
Она основана на специфическом взаимодействии между антителами человека (или агглютининами) и микробными клетками (агглютеногенами). После их взаимодействия образуются частицы, которые выпадают в осадок. Это и есть положительный признак. Для постановки реакции могут использоваться живые или убитые микробные агенты, грибы, простейшие, и соматические клетки.
Химически реакция разбита на два этапа:
- Специфическое соединение антител (АТ) с антигенами (АГ).
- Неспецифическая - осаждение конгломератов АГ-АТ, то есть образование агглютината.
Реакция непрямой агглютинации (РПГА)
Для ее постановки используют очищенные бараньи эритроциты и красные кровяные тельца человека, предварительно обработанные антителами или антигенами (это зависит от того, что именно лаборант хочет найти). В некоторых случаях человеческие эритроциты обрабатывают иммуноглобулинами. Серологические реакции эритроцитов считаются состоявшимися, если произошло их осаждение на дно пробирки. О положительной реакции можно говорить, когда клетки располагаются в виде перевернутого зонтика, занимая все дно. Отрицательная реакция засчитывается, если эритроциты осели столбиком или в виде пуговки в центре дна.
Реакция преципитации (РП)
Серологические реакции этого типа служат для выявления крайне малых частиц антигенов. Это могут быть, например, белки (или их части), соединения белков с липидами или углеводами, части бактерий, их токсины.
Сыворотки для проведения реакции получают путем искусственного заражения животных, обычно кроликов. Таким методом можно получит абсолютно любую преципитирующую сыворотку. Постановка серологических реакций преципитации похожа по механизму действия на реакции агглютинации. Антитела, содержащиеся в сыворотке, соединяются с антигенами в образуя крупные белковые молекулы, которые осаждаются на дно пробирки или на субстрат (гель). Этот способ считается высокоспецифичным и может обнаружить даже ничтожно малые количества вещества.
Используется для диагностики чумы, туляремии, сибирской язвы, менингита и других заболеваний. Кроме того, задействован в судебно-медицинской экспертизе.
в геле
Серологические реакции можно проводить не только в жидкой среде, но и в агаровом геле. Это называется метод диффузной преципитации. С его помощью изучают состав сложных антигенных смесей. Этот способ основан на хемотаксисе антигенов к антителам и наоборот. В геле они движутся навстречу друг другу с разной скоростью и, встречаясь, образуют линии преципитации. Каждая линия - один комплект АГ-АТ.
Реакция нейтрализации экзотоксина антитоксином (РН)
Антитоксические сыворотки способны нейтрализовать действие экзотоксина, который вырабатывают микроорганизмы. На этом и основаны данные серологические реакции. Микробиология использует этот способ для титрования сывороток, токсинов и анатоксинов, а также определения их лечебной активности. Сила нейтрализации токсина определяется условными единицами - АЕ.
Кроме того, благодаря этой реакции можно определить видовую или типовую принадлежность экзотоксина. Это применяется при дифтерии, ботулизма. Исследование можно проводить как «на стекле», так и в геле.
Реакция лизиса (РЛ)
Иммунная сыворотка, которая попадает в организм больного, обладает, кроме своей основной функции пассивного иммунитета, еще и лизирующими свойствами. Она способна растворять микробные агенты, клеточные чужеродные элементы и вирусы, поступающие в организм больного. В зависимости от специфичности входящих в состав сыворотки антител выделяют бактериолизины, цитолизины, спирохетолизины, гемолизины и другие.
Эти специфические антитела называются "комплемент". Он содержится практически во всех жидкостях тела человека, имеет сложную белковую структуру и крайне чувствителен к повышению температуры, встряхиванию, действию кислот и прямых солнечных лучей. Но в высушенном состоянии способен сохранять свои лизирующие свойства до полугода.
Существуют такие виды серологических реакций этого типа:
Бактериолиз;
Гемолиз.
Бактериолиз проводят, используя сыворотку крови пациента и специфическую иммунную сыворотку с живыми микробами. Если в крови присутствует достаточное количество комплемента, то исследователь увидит лизис бактерий, и реакция будет считаться положительной.
Вторая серологическая реакция крови заключается в том, что взвесь эритроцитов больного обрабатывают сывороткой, содержащей гемолизины, которые активизируются только в присутствии определенного комплимента. Если таковой имеется, то лаборант наблюдает растворение красных клеток крови. Данная реакция широко используется в современной медицине для определения титра комплемента (то есть его наименьшего количества, провоцирующего лизис эритроцитов) в сыворотке крови и для постановки анализа на связывание комплемента. Именно этим способом проводится серологическая реакция на сифилис -
Реакция связывания комплемента (РСК)
Эта реакция используется для того, чтобы обнаружить в сыворотке крови больного антитела к инфекционному агенту, а также с целью идентифицировать возбудителя по его антигенной структуре.
До этого момента мы описывали простые серологические реакции. РСК считается сложной реакцией, так как в ней взаимодействуют не два, а три элемента: антитело, антиген и комплемент. Суть ее заключается в том, что взаимодействие между антителом и антигеном происходит только в присутствии белков комплимента, которые адсорбируются на поверхности образовавшегося комплекса АГ-АТ.
Сами антигены, после присоединения комплемента, подвергаются существенным изменениям, которые и показывают качество проведенной реакции. Это может быть лизис, гемолиз, иммобилизация, бактерицидное или бактериостатическое действие.
Сама реакция происходит в две фазы:
- Образование комплекса антиген-антитело, которое визуально не заметно исследователю.
- Изменение антигена под действием комплемента. Эта фазу чаще всего можно отследить невооруженным глазом. Если же визуально реакции не видно, то используют дополнительную индикаторную систему, позволяющую выявить изменения.
Индикаторная система
Данная реакция основана на связывании комплемента. В исследуемую пробирку спустя час после постановки РСК добавляют очищенные эритроциты барана и гемолитическую сыворотку, не содержащую комплемента. Если в пробирке остался несвязанный комплемент, то он присоединится к комплексу АГ-АТ, образованному между бараньими клетками крови и гемолизином, и вызовет их растворение. Это будет означать, что РСК отрицательна. Если эритроциты остались целыми, то, соответственно, реакция положительная.
Реакция гемагглютинации (РГА)
Существуют две принципиально разные реакции гемагглютинации. Одна из них - серологическая, она используется для определения групп крови. В этом случае эритроциты взаимодействуют с антителами.
А вторая реакция не относится к серологическим, так как красные кровяные тельца реагируют с гемагглютининами, продуцируемыми вирусами. Так как каждый возбудитель действует только на конкретные эритроциты (куриные, бараньи, обезьяньи), то можно считать эту реакцию узкоспецифичной.
Понять, положительная реакция или отрицательная, можно по расположению клеток крови на дне пробирки. Если их рисунок напоминает перевернутый зонтик, значит, искомый вирус присутствует в крови больного. А если все эритроциты сложились наподобие монетного столбика, то искомых возбудителей нет.
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА)
Это высокоспецифичная реакция, позволяющая установить вид, тип вирусов или наличие специфических антител в сыворотке крови пациента.
Суть ее заключается в том, что антитела, добавленные в пробирку с исследуемым материалом, препятствую осаждению антигенов на эритроцитах, тем самым останавливая гемагглютинацию. Это и является качественным признаком наличия в крови специфических антигенов к конкретному искомому вирусу.
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ)
В основе реакции лежит способность выявлять комплексы АГ-АТ при после их обработки флюорохромными красителями. Это метод прост в обращении, не требует выделения чистой культуры и занимает мало времени. Он незаменим для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний.
В практике эти серологические реакции делятся на два вида: прямые и непрямые.
Прямая РИФ производится с антигеном, который заранее обработан флюоресцирующей сывороткой. А непрямая заключается в том, что сначала препарат обрабатывают обычным диагностикумом, содержащим антигены к искомым антителам, а затем повторно наносится люминесцентная сыворотка, которая специфична к белкам комплекса АГ-АТ, и микробные клетки становятся заметны при микроскопии.
Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) более чувствительна и специфична, чем реакция агглютинации. Эту реакцию также используют в двух направлениях.
1) Для обнаружения антител в сыворотке крови больного применяются эритроцитарные диагностикумы, в которых антиген адсорбирован на поверхности обработанных танином эритроцитов. В отношении этой реакции чаще употребляют термин РПГА.
Исследуемую сыворотку разводят в лунках пластмассовых планшетов и добавляют эритроцитарный диагностикум. При положительной реакции появляется тонкая пленка по стенкам лунки в виде "кружевного зонтика», при отрицательной реакции - плотный осадок эритроцитов в виде "пуговки".
2) Для обнаружения токсинов и бактериальных антигенов в исследуемом материале применяют антительные эритроцитарные диагностикумы, полученные путем адсорбции антител на эритроцитах. В отношении этой реакции чаще употребляется термин РНГА. Например, с помощью антительных диагностикумов обнаруживают антиген палочки чумы, дифтерийный экзотоксин, ботулинический экзотоксин.
Реакция Кумбса (аптиглобулиновый тест)
Реакцию применяют для выявления неполных антител, например, антител к резус-фактору. К Rh + эритроцитам добавляют исследуемую сыворотку, в которой предполагается присутствие неполных антител к резус-фактору. Присоединившись к эритроцитам, неполные антитела не вызывают агглютинации, так как имеют только один активный центр. Затем добавляют антиглобулиновую сыворотку, содержащую антитела к глобулинам человека. Соединившись с неполными антителами, антиглобулиновая сыворотка вызывает агглютинацию эритроцитов.
Реакция преципитации
Сущность реакции состоит в осаждении (преципитации) антигена под действием специфических антител. Для получения видимой реакции необходимо присутствие электролита. Антигеном в реакции преципитации являются молекулярно-дисперсные вещества.
Реакция кольцепреципитации ставится в узких преципитационных пробирках. В пробирку наливают иммунную сыворотку, на нее осторожно наслаивают исследуемый материал. При наличии в нем антигена на границе двух жидкостей образуется непрозрачное кольцо преципитата.
Реакцию применяют в судебной медицине для определения видовой принадлежности белков в кровяных пятнах, в сперме и т.д.; для определения антигена при диагностике сибирской язвы (реакция Асколи), менингита и других инфекций; в санитарно-гигиенических исследованиях - для установления фальсификации пищевых продуктов. Иммунные преципитирующие сыворотки получают путем иммунизации животных соответствующим антигеном. Например, сыворотка, преципитирующая белок человека, получена путем иммунизации кролика белком человека. Титр преципитирующей сыворотки - это наибольшее разведение антигена, с которым она дает реакцию. Сыворотку обычно применяют неразведенной или в разведении 1:5.
Реакция преципитации в агаровом геле проводится несколькими методами. Это реакция двойной иммунодиффузии, реакция радиальной иммунодиффузии, реакция иммуноэлектрофореза.
Реакция двойной иммунодиффузии (по Оухтерлони). Растопленный агаровый гель выливают в чашку Петри и после затвердевания в нем вырезают лунки. В одни лунки помещают антиген, в другие - иммунные сыворотки, которые диффундируют в агар, образуют в месте встречи преципитат в виде белых полос.
Реакция радиальной иммунодиффузии (по Манчини). В растопленный агаровый гель вносят иммунную сыворотку, выливают в чашку. После застывания агара в нем вырезают лунки и помещают в них антигены, которые, диффундируя в агар, образуют кольцевые зоны преципитации вокруг лунок. Чем выше концентрация антигена, тем больше диаметр кольца. Реакцию применяют, например, для определения в крови иммуноглобулинов различных классов. Иммуноглобулины классов IgG, IgM, IgA действуют в этой реакции как антигены, а антитела против них содержатся в специфических мо-норецепторных сыворотках.
Иммуноэлектрофорез. В агаровом геле проводят электрофорез белковых антигенов. В канавку, которая идет параллельно направлению движения белков, вносят преципитирующую сыворотку. Антигены и антитела диффундируют в агар, и в месте их встречи образуются линии преципитации.
Реакции иммунного лизиса
Антиген (эритроциты или бактерии), соединившись со специфическими антителами, образует иммунный комплекс, к которому присоединяется комплемент (С1), и происходит активация комплемента по классическому пути. Активированный комплемент лизирует эритроциты (гемолиз) или бактерии (бактериолиз). Реакция бактериолиза применяется для идентификации холерного вибриона.
Реакция гемолиза. Антигеном в реакции служат эритроциты, антитела (гемолизины) содержатся в гемолитической сыворотке. Гемолизины присоединяются к эритроцитам, происходит активация комплемента, который лизирует эритроциты. Мутная взвесь эритроцитов превращается в прозрачную ярко-красную жидкость - «лаковую кровь». Поскольку реакция гемолиза происходит только в присутствии комплемента, ее применяют как индикаторную для обнаружения комплемента.
Реакция локального гемолиза в геле (реакция Ерне) - вариант реакции гемолиза. Служит для определения количества антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и лимфатических узлах.
Растопленный агаровый гель смешивают с суспензией клеток селезенки и эритроцитами и после застывания агара добавляют комплемент. Вокруг каждой клетки, продуцирующей гемолизины, образуется зона гемолиза. По числу таких зон определяют количество клеток, продуцирующих гемолизины.
Главная → Анализы → Иммунологический метод → Реакции гемагглютинации (иммунологический метод)
Реакции агглютинации основаны на взаимодействии реагента (антител) с антигенами, находящимися на поверхности клеток или инородных частиц. В результате образуются агрегаты крупного размера, которые выпадают в осадок и их можно увидеть даже невооруженным глазом. Таким образом определяют группу крови по системе АВО, наличие в ней резус-фактора и др. Это более чувствительный по сравнению с реакциями преципитации способ диагностики, так как объем осадка (агглютината) превосходит объем преципитата.
Прямая гемагглютинация
Реакция прямой гемагглютинации (РПГА) используется для выявления поверхностных антигенов микроорганизмов и эритроцитов, а также антител к ним.
К стандартным сывороткам, содержащим антитела, добавляют исследуемый материал (кровь). Скорость прямой реакции агглютинации связана с количеством исследуемого материала, количеством и концентрацией сыворотки, температурой окружающей среды.
Непрямая гемагглютинация
Реакцию непрямой гемагглютинации проводят для выявления антител в крови пациента с помощью эритроцитарного диагностикума. Реагент представляет собой эритроциты, на поверхности которых расположен антиген (белки микроорганизмов, токсинов, аллергенов и др.).
Сыворотку крови пациента разводят 0,9 %-ным раствором натрия хлорида, затем добавляют эритроцитарный диагностикум и отслеживают результат. Этот высокочувствительный способ диагностики выявляет антигены даже в небольших концентрациях.
Реакция гемагглютинации (РГА).
В лаборатории пользуются двумя различными по механизму действия реакциями гемагглютинации.
Первая РГА относится к серологическим. В этой реакции эритроциты агглютинируются при взаимодействии с соответствующими антителами (гемагглютининами). Реакцию широко используют для определения групп крови.
Вторая РГА не является серологической. В ней склеивание эритроцитов вызывают не
антитела, а особые вещества, образуемые вирусами. Например, вирус гриппа агглютинирует эритроциты кур и морских свинок, вирус полиомиелита — эритроциты барана. Эта реакция позволяет судить о наличии того или иного вируса в исследуемом материале.
Реакцию проводят в пробирках или на специальных пластинках с лунками. Исследуемый на наличие вируса материал разводят изотоническим раствором от 1:10 до 1:1280; 0,5 мл каждого разведения смешивают с равным объёмом 1-2% взвеси эритроцитов. В контроле 0,5 мл эритроцитов смешивают с 0,5 мл изотонического раствора. Пробирки ставят на 30 минут в термостат, а пластины оставляют при комнатной температуре на 45 минут.
Учёт результатов. При положительном результате реакции на дне пробирки или лунки выпадает осадок эритроцитов с фестончатыми краями («зонтик»), покрывающий всё дно лунки. При отрицательном результате эритроциты образуют плотный осадок с ровными краями («пуговку»). Такой же осадок должен быть в контроле. Интенсивность реакции выражают знаками «+».
Реакция гемагглютинации
Титром вируса является максимальное разведение материала, в котором происходит агглютинация.
Реакция торможения гемагглютинации
Это серологическая реакция, в которой специфические противовирусные антитела, взаимодействуя с вирусом (антигеном), нейтрализуют его и лишают способности агглютинировать эритроциты, т. е. тормозят реакцию гемагглютинации. Эта реакция позволяет определить вид и тип вирусов.
Постановка реакции. 0,25 мл противовирусной сыворотки смешивают с равным объёмом материала, содержащего вирус. Смесь встряхивают и помещают в термостат на 30 минут, после чего добавляют по 0,5 мл’1-2% взвеси эритроцитов.
Учёт результатов. При правильной постановке опыта в контроле сыворотки и эритроцитов должна образоваться «пуговка» — нет агглютинирующего эритроциты фактора; в контроле антигена образуется «зонтик» — вирус вызвал агглютинацию эритроцитов. Если сыворотка гомологична изучаемому вирусу, образуется «пуговка» — сыворотка нейтрализовала вирус.
Реакция непрямой гемагглютинации
Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РИГА) основана на том, что эритроциты, если на их поверхности адсорбировать растворимый антиген, приобретают способность агглютинироваться при взаимодействии с антителами к адсорбированному антигену.
Постановка реакции. Сыворотку прогревают 30 минут при 56 °С, разводят последовательно в соотношении 1:10 — 1:1280 и разливают по 0,25 мл в пробирки или лунки, куда затем добавляют по 2 капли эритроцитов с адсорбированными на них антигенами.
Контроли: взвесь эритроцитов с адсорбированными на них антигенами с заведомо иммунной сывороткой, взвесь эритроцитов с адсорбированными на них антигенами с нормальной сывороткой; взвесь нормальных эритроцитов с испытуемой сывороткой. В первом контроле должна произойти агглютинация, во втором и третьем её не должно быть.
Контрольные вопросы.
1. О чем свидетельствует положительный результат РГА между эритроцитами и исследуемым на наличие вируса материалом?
2. Произойдет ли реакция агглютинации эритроцитов, если к ним добавить вирус и соответствующую ему сыворотку? Как называется реакция, выявляющая этот феномен?
ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №12.
Реакция связывания комплемента.
Реакция связывания комплимента (РСК) основана на том, что’ специфический комплекс антиген — антитело всегда адсорбирует на себе (связывает) комплемент.
Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов ив серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.
РКС-сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген-антитело. По существу, это две серологические реакции.
Правая система-основная состоит из антигена и антитела (один известный, др. нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплимент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.
Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т.е. готовый имунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой, то во второй системе гемолиза не будет- т.к. нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.
Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то имунный комплекс не образуется и комплимент останется свободным. Оставшийся свободным, комплимент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, результат РСК отрицательный(содержимое пробирок прозрачно-"лаковая кровь").
Компоненты, реакции связывания комплемента:
1. Антиген — обычно лизат, экстракт, гаптен,
реже взвесь микроорганизмов.
2. Антитело — сыворотка больного.
3. Комплемент — сыворотка морских свинок.
4. Антиген — эритроциты барана.
5. Антитело — гемолизин к эритроцитам барана.
6. Изотонический раствор.
Ввиду того, что в РСК участвует большое количество сложных компонентов,
они должны быть предварительно оттитрованы и взяты в реакцию в точных количествах и в равных объемах: по 0,5 или 0,25 , реже по 0,2,1,25 или 1,0 мл (большие объемы дают более точный результат). Титрование компонентов реакции проводят в том же объеме, в каком ставят опыт, заменяя недостающие ингредиенты изотоническим раствором.
Похожая информация:
Поиск на сайте:
Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) более чувствительна и специфична, чем реакция агглютинации. Эту реакцию также используют в двух направлениях.
1) Для обнаружения антител в сыворотке крови больного приме-няются эритроцитарные диагностикумы, в которых антиген адсорби-рован на поверхности обработанных танином эритроцитов. В отноше-нии этой реакции чаще употребляют термин РПГА.
Исследуемую сыворотку разводят в лунках пластмассовых план-шетов и добавляют эритроцитарный диагностикум. При положитель-ной реакции появляется тонкая пленка по стенкам лунки в виде "кру-жевного зонтика», при отрицательной реакции — плотный осадок эрит-роцитов в виде "пуговки".
2) Для обнаружения токсинов и бактериальных антигенов в исс-ледуемом материале применяют антительные эритроцитарные диагнос-тикумы, полученные путем адсорбции антител на эритроцитах. В от-ношении этой реакции чаще употребляется термин РНГА. Например, с помощью антительных диагностикумов обнаруживают антиген па-лочки чумы, дифтерийный экзотоксин, ботулинический экзотоксин.
Что такое эритроцитарный диагностикум? Что такое антительный эритроцитарный диагностикум?
Эритроцитарные диагностикумы представляют собой эритроциты (обработанные танином или формалином) с адсорбированными на них антигенами, извлеченными из бактерий, и применяются в РПГА (реакции пассивной гемагглютинации). В том случае, когда РПГА используется для выявления антигена в выделениях больных, в тканях и др., применяют «антительные диагностикумы», т. е. эритроциты, сенсибилизированные антителами.
В РНГА выявляют антитела сыворотки крови с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами.
Методика постановки реакций. Реакция коагглютинации.
— фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
— обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
— сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.
Реакция коагглютинации (РКА)
Реакцию коагглютинации применяют для определения антигенов с помощью антител, адсорбированных на белке А клеток стафилококка (антительный диагностикум).
Белок А имеет сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, поэтому такие бактерии, обработанные иммунной диагностической сывороткой неспецифически адсорбируют антитела сыворотки, которые затем взаимодействуют активными центрами с соответствующими микробами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител диагностической сыворотки и определяемого микроба.
Агглютинирующие сыворотки: что они содержат; как их получают, для чего применяются; что такое титр агглютинирующей сыворотки?
Агглютинирующую сыворотку получают иммунизацией кроликов (внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно) взвесью убитых бактерий, начиная с дозы 200 млн., затем 500 млн., 1 млрд., 2 млрд., микробных тел в 1 мл, с интервалами 5 дней. Через 7-8 дней после последней иммунизации берут кровь и определяют титр антител.
Титром агглютинирующей сыворотки называется то максимальное разведение сыворотки, при котором происходит агглютинация с соответствующим микроорганизмом.
Агглютинирующие сыворотки применяются при идентификации микроба в развернутой реакции агглютинации.
Реакция гемагглютинации (РГА)
Если изучаемый микроорганизм агглютинируется сывороткой до титра или до половины значения титра, его можно считать принадлежащим к тому виду, название которого указано на этикетке ампулы.
В чём различия между поливалентными и моновалентными (монорецепторными) агглютинирующими сыворотками; почему при иммунизации кролика микробами одного вида получается сыворотка, содержащая антитела к нескольким антигенам?
Монорецепторные сыворотки — сыворотки, содержащие антитела толь-ко к одному антигену, и поливалентные сыворотки, дающие реакции аг-глютинации с двумя-тремя родственными бактериями, имеющими об-щий антиген. Агглютинирующие сыворотки применяют для идентификации микроорганизмов в реакции агглютинации. Недостатком таких сывороток является то, что они спо-собны давать групповые реакции агглютинации, т.к. они содержат ан-титела к бактериям, имеющим общие антигены.
Реакция гемагглютинации. Описание и применение
Основана на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены, приобретают способность агглютинироваться в присутствии гомологичных сывороток (антител).
Эритроциты при этом выполняют роль носителей со специфическими детерминантами, агглютинация которых происходит в результате реакции антиген + антитело.
Эритроциты, к поверхности которых прочно присоединены антигены, называют эритроцитарным антигенным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антигеном.
Другой тип РНГА - на поверхности эритроцитов адсорбированы антитела и последующая их агглютинация происходит в присутствии гомологичного антигена. В этом случае такие эритроциты называют эритроцитарным антительным диагностикумом, или эритроцитами, сенсибилизированными антителами.
На основе этих двух принципиальных методических подходов разработаны и используются многие модификации РНГА. Так, в качестве носителей применяют мелкие стандартные частички латекса. В этом случае реакцию называют реакция латекс агглютинации (РЛА) или используют золотистый стафилококк - реакция коагглютинации и т. д. Обычно эритроцитарные диагностикумы готовят на предприятиях биологической промышленности, а в диагностических лабораториях ставят уже главный опыт РНГА.
Приготовление эритроцитарных диагностикумов включает следующие этапы:
- фиксация эритроцитов формальдегидом или глютаровым, или акриловым альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Чаще для этой цели используют эритроциты барана, человека, кур и др.;
- обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В результате эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на своей поверхности белки (вирусы и антитела);
- сенсибилизация танизированных эритроцитов вирусами или антителами.
Необходимо отметить, что методы приготовления эритроцитарных диагностикумов для вирусных инфекций различна.
Методика постановки РНГА для обнаружения и определения титра антител заключается в следующем:
- к последовательным 2-кратным разведениям сыворотки добавляют равные дозы эритроцитов, сенсибилизированных антигеном;
- смесь оставляют на 2-3 ч при комнатной температуре или на 16-18 ч при 4 °С;
- учитывают результаты. Если в сыворотке содержатся антитела к вирусу, которым были сенсибилизированы эритроциты, наблюдают гемагглютинацию, которую оценивают в крестах.
За титр антител в сыворотке принимают наивысшее разведение сыворотки, которое еще обеспечивает гемагглютинацию не менее чем на два креста.
РНГА сопровождается всеми соответствующими контролями. Обычно ставят реакцию микрометодом.
РНГА позволяет решать следующие диагностические задачи:
- обнаружить антитела и определить их титр в сыворотке крови с помощью известного эритроцитарного антигенного диагностикума;
- обнаружить и идентифицировать неизвестный вирус с помощью известного эритроцитарного антительного диагностикума.
Достоинства РНГА: высокая чувствительность, простота техники постановки и быстрота ответа. Однако важно отметить, что возникают большие трудности в приготовлении стабильных эритроцитарных диагностикумов (большая зависимость от чистоты используемых компонентов, необходимость подбора режима фиксации, танизации и сенсибилизации эритроцитов для каждого вида вируса).
Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.
Вконтакте
